离心技术是利用离心力,依据物质的沉降系数、扩散系数和浮力密度的差异而进行物质的分离、浓缩和分析的一种专门技术。
区带转子避免了用离心管所引起的壁效应(Walleffects)和干扰,提高了分辨率。
垂直转子(Vertical-Tube-Rotor):
主要用于样品在短时间作密度梯度离心。甩平转子分离粒子位移距离长,分辨能力高,分离后组分的区带较宽,便于回收,但所需时间长,垂直转子分离的粒子位移距离等于离心管直径。转子转动前,管内密度梯度溶液的密度是沿重力方向变化,转动后,溶液的密度逐渐改变为离心力方向(水平方向)变化,离心结束后,溶液的密度变化方向因重力作用又沿铅垂方向变化,形成铅垂方向的密度梯度,由于离心管是垂直放置,所以溶液粒子位移的距离等于离心管的直径。离心时间短,离心后样品组分的区带较宽,但因离心时间短,粒子得不到充分分离,将会失去一些组分,又因区带与梯度介质的接触面大,易于扩散,停机后密度重新定向,易于混合,所以作区带离心的效果,垂直转子不于甩平转子。
离心机转子的转速跟转子的材料和强度有关,一般采用强度好、重量轻的超硬铝合金(LC4),超速离心机采用钛合金(TiC4)。一般来说,对同一离心机重量轻、容量小的转子转速要高,反之转速要低。
(二)减压浓缩优点是:①压力降低,溶液的沸点降低,能防止或减少热敏性物质的分解;②增大了传热温度差,蒸发效率提高;③能不断地排除溶剂蒸汽,有利于蒸发顺利进行;④沸点降低,可利用低压蒸汽或废气作加热源;⑤密闭容器可回收乙醇等溶剂。但是,溶液沸点下降也使粘度增大,又使总传热系数下降。1.减压蒸馏器 在减压及较低温度下使药液得到浓缩,同时可将乙醇等溶剂回收。2.真空浓缩罐 用水流喷射泵抽气减压,适于水提液的浓缩。3.管式蒸发器
(三)薄膜浓缩特点:①浸提液的浓缩速度快,受热时间短;②不受液体静压和过热影响,成分不易被破坏;③能连续操作,可在常压或减压下进行;④能将溶剂回收重复使用。1.升膜式蒸发器 适用于蒸发量较大,有热敏性、粘度适中和易产生泡沫的料液。不适用高粘度、有结晶析出或易结垢的粒液。2.降膜式蒸发器 适于蒸发浓度较高、粘度较大的药液,由于降膜式没有液体静压强作用,沸腾传热系数与温度差无关,即使在较低传热温度差下,传热系数也较大,对热敏性药液的浓缩更有益。3.刮板式薄膜蒸发器 适于高粘度、易结垢、热敏性药液的蒸发浓缩,但结构复杂,动力消耗大。4.离心式薄膜蒸发器 适于高热敏性物料蒸发浓缩。
(四)多效浓缩可节省能源,提高蒸发效率。按药液加入方式的不同把三效蒸发分为四种流程。①顺流加料法。②逆流加料法。③平流加料法。④错流加料法。注意:①真空度过大或过小,均影响浓缩效率。②浓缩至一定程度时,料液极易产生泡沫,出现跑料。③一效加热器蒸汽压力应保持在设计范围内,若其压力明显升高,可能是收膏时膏料在管壁结垢而影响传热,应打开加热器清除垢层。
三、组织:肠黏膜
目的:WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒转混匀,置室温10min
离心:12000g,10min,4度,弃上清
加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)