1)速度区带离心法
速度区带离心法是在离心前离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等),待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间,同梯度液一起离心。由于离心力的作用,颗粒离开原样品层,按不同沉降速度向管底沉降,离心一定时间后,沉降的颗粒逐渐分开,后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大,往下沉降越快,所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒,则在较上部分依次出现。在离心过程中,区带的位置和形状(或宽度)随时间而改变,因此区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性,也与离心时间有关。时间越长,区带越宽,适当增加离心力可缩短离心时间,并减少扩散所导致的区带加宽现象,增加区带面的稳定性。
归纳起来有两种密度梯度液,一种密度随管长或半径呈阶梯式增加,为不连续梯度。另一种是密度随管长或半径逐渐增加为连续梯度。
不连续密度梯度制备:通常先配好一系列不同密度的溶液,然后用移液管将梯度介质由浓到稀沿管壁小心加入,或用一加细管的注射器针头插到管底,从稀到浓一层层地铺到离心管中,即可产生一个不连续的密度梯度。
连续密度梯度制备:简单的设备包括两个柱形的容器。中间装一连通管,连通管上安装有活塞开关,两边为储存室和混合室,后者内装有搅拌器,通过导液管使混合液流入离心管中。离心管顶部和底部所需要的两种不同密度溶液,分别装入储存室和混合室内。将较浓的溶液放在混合室中,较稀的溶液放在储存室中。开动搅拌器,打开接通管活塞,控制流速。导液管口必须紧贴离心管壁,(或导液管口插到管底部位并位于其中心),因为这样从混合室中流出蔗糖溶液的浓度以线性速率减低,使溶液沿离心管壁流下,可以避免扰乱已形成的密度梯度。
2)等密度离心法
某些密度梯度介质经过离心后会自身形成梯度,如Percoll则可迅速形成梯度,CsCl、Cs2SO4和三碘苯甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合,梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部浓而管顶稀的密度梯度,与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度即ρm>ρp时,颗粒上浮;当管顶介质的密度小于颗粒的密度即ρp>ρm时,则颗粒沉降;后颗粒进入到一个它本身的密度位置即ρp=ρm,颗粒不再移动,形成稳定的区带。等密度离心法需时间较长,一般为十几小时至几十小时。
梯度材料的选择原则 ①对被分离的生物样品无作用,不会使生物样品失活;②在溶液中稳定,在离心作用下不会解离或聚合;③在使用的密度范围中,粘度低,渗透压小,离子强度及pH值变化小;④易与被分离的颗粒分开;⑤不会对离心机设备发生腐蚀作用;⑥便于浓度测定等等。这些原则当然比较理想,完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料:
(1)糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖(ficoll)、右旋糖酐、糖原等。
(2)无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等。
(3)有机碘化物:三磺苯甲酰葡萄糖胺(martizamide)等。
(4)硅溶胶:Ludox的各种类型,如Percoll。
梯度液的收集 离心后颗粒在梯度液中分层,小心取出离心管,防止振摇以避免分层的
颗粒混和。收集梯度液中颗粒的方法很多,有管底穿孔计滴法、插管虹吸计滴法,浓液顶替法和注射器穿孔抽取法等。
6、食品
随着文化议识的提高,对食品饮食等问题越来越重视,健康、科学的食品越来越受的关注。食品安全问题越来越备受关注。严格的控制食品的质量成为食品加工企业及相关检测机构的重要手段。食品的理化性能及营养成份分析、含量等等都成食品行业实验室的重要控制目标。
超高速离心机分离方法
一:差速离心:逐次增加离心力,每次可沉降样品溶液中的一些组份。
差速离心是一种常用的方法。在这种方法中,离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在一定速度下一定时间的离心后,就可得到两个部份:沉淀和上清液。
通常在次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以更高速度离心,把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当,使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心,直到达到所需要的分离纯度为止。
差速离心的特点是操作简单,但分离纯度不高。
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